【Key words】 Tympanic membrane perforation; Epithelium; Rats,Sprague-Dawley

临床上由于外伤或中耳炎等引起的鼓膜穿孔常见，有些能自行修复，而有些则不能，其中的原因和机制目前知之甚少。寻找影响鼓膜穿孔自然愈合的因素，了解穿孔修复的启动和自愈过程，有助于临床上早期干预和选择更好的治疗方式。

早期研究观察到墨汁在鼓膜表面的移动，是从鼓膜脐部离心性的。鼓膜上皮有移行的现象，说明上皮增生有特定的中心，但对上皮移行的方向以及上皮增殖中心的位置有不同的看法，过去的研究表明，大鼠与人类的鼓膜的结构和上皮移行最为相似，本组观察大鼠鼓膜穿孔后的组织改变，研究不同情况下鼓膜急性穿孔的修复过程，报道如下。

材料与方法

50只（100耳）健康雌性Sprague-Dawley大鼠（250～270g，5个月龄），由复旦大学上海医学院实验动物中心提供，鼓膜形态正常。使用随机数字表将大鼠随机分成5组，每组10只。显微镜下用细针和显微镰状刀作组内相同规格的穿孔，穿孔大小在显微镜下用自制显微钩针量度：

1、第1组：双耳鼓膜紧张部直径2.5mm中央大穿孔，左耳作锤骨柄前方穿孔，右耳作锤骨柄后方穿孔，保留鼓环和锤骨柄完整。

2、第2组：双耳鼓膜锤骨柄后紧张部中央直径1mm小穿孔。

3、第3组：双耳紧张部后方直径1.5mm边缘性穿孔，用刀将鼓膜刮除至鼓环。

4、第4组：双耳紧张部鼓膜3/4切除，保留鼓环和锤骨柄完整，在右侧耳的锤骨柄上涂上浓酸溶液，破坏其上附着的上皮和血管，左耳不作处理。

5、第5组：松弛部中央1.5mm穿孔。

另外，对第1组中4只大鼠鼓膜穿孔愈合后再次作双耳紧张部2/3切除。

显微镜下观察鼓膜愈合情况，记录穿孔愈合的时间。在穿孔后第1、2、3、6d和穿孔愈合后，用盐酸氯胺酮（80mg/kg）肌肉注射麻醉动物，显微镜下将部分外耳道、鼓膜和鼓环周围的骨质一同取下，保持锤骨柄良好附着于鼓膜。立即置入4℃的4%多聚甲酫固定24h，经10%乙二胺四乙酸脱钙14d后石蜡切片，层厚5μm，HE染色。

结果

所有鼓膜穿孔在4～9d内愈合，没有感染发生。显微镜下观察：

一、鼓膜紧张部穿孔

1、穿孔第1天，不管穿孔大小和位置，即使远离穿孔区域，所有鼓环和锤骨柄周围鼓膜变白、不透明和增厚，尤其以上半部分鼓膜明显，显示组织增生。组织切片可看到，在穿孔边缘上皮和粘膜层向鼓环方向退缩，鼓环区域上皮增生，细胞层数增加，厚度变为原来的6～8倍，靠近穿孔边缘的鼓膜上皮无增生，纤维层无明显变化。鼓环区域上皮增生比锤骨柄周围明显。

2、穿孔第2天，鼓环和锤骨柄处细胞增生更加明显，尤其当穿孔边缘靠近它们时。鼓环处上皮层厚度增加到原来的10～20倍，细胞变大，由薄的扁平状变成多边形，核浆比例增大，胞核蓝染面积增加，有的细胞可见分裂象，细胞之间的间距增加，上皮层和纤维之间可看到间隙，上皮层增厚向穿孔方向扩展。纤维层和粘膜层细胞无明显增生。

3、穿孔第3天，穿孔边缘上皮细胞堆积，表面可看到角质层，上皮和纤维层之间疏松。上皮堆积在穿孔的上方明显，呈倒U字形，大穿孔边缘的上皮堆积比小穿孔明显。紧张部穿孔未见有松弛部上皮增殖。单侧耳鼓膜穿孔，健侧耳鼓膜无明显变化。鼓膜穿孔后，外耳道上皮细胞无明显变化。

4、穿孔第6天，有的穿孔基本愈合，有的呈裂隙状，残余穿孔的位置在原来穿孔的中心。鼓膜后方边缘穿孔的上皮细胞未进入鼓室，而是朝锤骨柄方向封闭穿孔。

5、鼓膜紧张部3/4切除的穿孔全部愈合，锤骨柄未用铬酸处理的穿孔愈合后鼓膜保持了原有的鼓膜形态，新生鼓膜附着于锤骨柄上。经铬酸处理锤骨柄的穿孔愈合后变平坦，大体标本见锤骨柄突向鼓室腔，新生鼓膜不附着于锤骨柄，光镜下可看到鼓膜穿孔愈合不依赖锤骨柄，锤骨柄表面无上皮和粘膜附着。

6、穿孔愈合后再次大穿孔的鼓膜，愈合过程和第一次穿孔的鼓膜相似，也全部在9天内愈合，二次穿孔后再次愈合的鼓膜在光镜下仍然维持三层结构。

二、松弛部穿孔

松弛部穿孔愈合快，局部渗出多，易出血，穿孔第1天即有上皮下结缔组织增生，上皮细胞无明显退缩，上皮层的增厚表现为整个穿孔周围均匀增厚，覆盖于纤维层表面，穿孔边缘的细胞堆积不如紧张部穿孔明显。松弛部穿孔伴有紧张部鼓环周围上皮的轻度增生。

三、不同鼓膜穿孔的愈合时间（表1）

紧张部所有穿孔的愈合时间组间差别经方差检验（F检验）无统计学意义（F=1.70，P＞0.05）松弛部穿孔比紧张部穿孔愈合快，差别有统计学意义（F=29.66，P＜0.01＝

表1不同穿孔的愈合时间

讨论

鼓膜上皮有移行现象，被认为可以保持鼓膜表面洁净，上皮移行还参与了穿孔的愈合。本实验紧张部中央穿孔后早期，穿孔边缘上皮退缩，无细胞增殖，说明紧张部中央上皮细胞与下层的纤维连接不紧密，紧张部中央上皮细胞可能由它处移行而来。过去一些研究认为鼓膜上皮由脐部和锤骨柄上向鼓环方向离心性移行，但也有作者观察到正常鼓膜上皮的向心性移行，鼓室胆脂瘤的形成，也是上皮的向心性移行造成。1997年Kakoi观察溴代脱氧尿嘧啶标记细胞的移行和细胞增殖指标增殖细胞核抗原和Ki-67的分布，认为鼓膜上皮的生发中心位于锤骨柄和鼓环两个区域。

穿孔后的细胞增殖首先出现于远离穿孔的鼓环和锤骨柄区域，尤以鼓环为著，穿孔边缘无细胞增殖，随后上皮层增厚逐渐向穿孔方向扩展，另外，鼓环和锤骨柄处上皮细胞首先出现细胞间隙增加，细胞间隙增加逐渐向穿孔边缘扩展，说明穿孔边缘的细胞堆积，不是局部增殖产生，而是从鼓环或锤骨柄外移行而来。可以推测，鼓膜上皮的增殖中心位于鼓环和锤骨柄处，而细胞间隙增加可能是移行造成，或便于细胞的移行。

穿孔修复早期，只有上皮增生，而且穿孔首先由上皮封闭，显示上皮层在穿孔修复的过程中起了最为重要的作用。这一组织学特点可以解释临床上鼓膜穿孔的手术修复只要能提供上皮一个支架就有很好的治疗效果。穿孔修复的末期，原来圆形的穿孔变为裂隙状，而且穿孔愈合是两边等的，残余穿孔的位置在原来穿孔的中心。说明穿孔的愈合主要是由鼓环和锤骨柄两个方向细胞增生完成。

紧张部穿孔的大小和愈合时间无相关性，可用以下观点解释，穿孔的修复需要靠远离穿孔的鼓环和锤骨柄细胞移行来完成，穿孔愈合的速度依赖于鼓环和锤骨柄细胞的移行距离，即鼓膜直径相同，则愈合时间相同。

破坏锤骨柄后穿孔仍能愈合，不需锤骨柄的参与，而且，在中小穿孔中，早期鼓环的细胞增生比锤骨柄显著，说明鼓膜的增殖是多中心的，鼓环在穿孔愈合过程中起重要作用。

紧张部穿孔不伴有松弛部上皮的增殖，但松弛部穿孔伴有紧张鼓环区域上皮的增殖，本实验无法解释其原因，但可说明鼓环上皮对创伤修复起重要的作用。一侧耳的鼓膜穿孔不引起对侧健耳鼓膜的变化，说明穿孔的修复启动机制和局部的炎性介质介导有关，与神经内分泌调节无关。

紧张部边缘性穿孔，未见上皮进入鼓室，而临床所见慢性中耳炎后鳞形上皮侵入鼓室，可能与鼓室粘膜炎性物质介导有关。上皮未进入鼓室可能与穿孔修复过程中的上皮移行的特点有关。因为上皮的移行不是依赖于纤维层的支持，而是依靠其自身产生的角质层，因此在修复的过程中，上皮靠外侧移行，这可能是上皮未进入鼓室的一个原因。

穿孔后鼓环和锤骨柄区域上皮增生活跃，另外，鼓环和锤骨柄区血供丰富，根据上皮干细胞的分布特点，可以推测，鼓膜上皮的干细胞位于这一区域，中耳手术时应重视对鼓环和锤骨柄的保护。

参与文献

1  Makino K, Amatsu M. Epithelial migration on the tympanic membrane and external canal. Arch Otorhinolaryngol,1986,243:39-42.

2  Michaels M, Soucek S . Auditory epithelial migration on the human tympanic membrane: Ⅱ. The existence of two discrete migratory pathways and their embryologic correlates. Am J Anat,1990,189:189-200.

3  Kakoi H, Anniko M, Pettersson CA. Auditory epithelial migration: I. Macroscopic evidence of migration and pathways in rat. Acta Otolaryngol,1996,116:435-438.

4  Kakoi H, Anniko M. Auditory epithelial migration .Ⅲ：An immunohistologic study using anti-BrdU antibody on tympanic membrane in mouse.Ann Otol Rhinol Laryngol,1997,106:414-421.

5  Kakoi H, Anniko M, Kinnefors A, et al.Auditory epidermal cell migration .Ⅶ.Antigen expression of proliferation cell nuclear antigens,PCNA and Ki-67 in human tympanic membrane and external auditory canal.Acta Otolaryngol,1997,117:100-108.

6  Schmidt SH, Hellstrom S.Tympanic membrane structure: new views. A comparative study. ORL J Otorhinolaryngol Relat Spec,1991,53:32-36.

7  Jonhson A. Hawke M.The function of migratory epidermis in the healing of tympanic membrane perforations in guinea-pig.A photographic study. Acta Otolaryngol,1987,103:81-86.